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点击次数:299 发布时间:2016/5/18

高效毛细管区带电泳色谱仪(CZE)又称自由溶液区带电泳仪,整个系统采用同一种缓冲液充满,以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,利用荷电粒子之间的淌度差异进行分离。
  一、工作原理:
  CZE中,粒子的电荷性质不同,电泳方向不同;粒子的电荷数量不同,电泳速度不同;粒子的分子量不同,电泳速度不同。在毛细管中,由于电渗流的存在,所有粒子都随电渗流一起向负极迁移,电渗流速度约是一般离子电泳速度的5~7倍。各种电性粒子在毛细管中的迁移速度分别为:
  1、阳离子:vap = veo+ vep,阳离子电泳方向与电渗流方向一致。
  2、阴离子:vap = veo-vep,阴离子电泳方向与电渗流方向相反。
  3、中性粒子:vap = veo,中性粒子运动方向与电渗流方向一致。
  当样品从阳极端注入毛细管时,不同电性的粒子将按不同速度向负极迁移,从负极端先后流出毛细管,出峰顺序依次是阳离子、中性粒子和阴离子。中性粒子无电泳现象,随电渗流同行,在阳离子后流出,但不同结构的中性粒子无法相互分离(电泳图上是一个峰)。
  电渗流在CZE中起着极其重要的作用:
  1、电渗流具有象HPLC中泵一样的作用,推动粒子前进,加上不同粒子电泳速度和方向的差异,完成阳离子、阴离子和中性粒子的分离。
  2、改变电渗流速度的大小和方向,可改变分离效率和选择性。这是CZE优化分离的重要因素。
  3、电渗流速度的微小变化会影响分离结果的重现性(迁移时间和峰面积)。
  二、特点:
  1、毛细管不涂敷任何固定液。
  2、结构简单,操作方便。
  3、不能分离电中性组分,因为电中性组分的淌度差为零。
  4、不能分离质荷比相近的组分,如蛋白质-SDS络合物。
  三、定性和定量分析:
  1、定性依据:不同组分的迁移时间不同。
  2、定量依据:电泳峰面积或峰高。
  四、操作条件:
  CZE操作条件包括缓冲液、添加剂、分离电压和分离温度等选择。
  1、缓冲液:
  CZE分离过程在缓冲液中进行,缓冲液的选择直接影响粒子的迁移和分离。
  配制缓冲液时,必须使用高纯蒸馏水和试剂。使用前要用0.45μm滤膜过滤以除去颗粒等。
  (1)选择缓冲液应遵循的条件:
  1)在所选择的pH范围内有很好的缓冲容量。
  2)在检测波长处无吸收或吸收值低。
  3)为达到有效的进样和合适的电泳淌度,缓冲液pH值至少与被测组分的等电点相差l个pH单位。
  4)自身淌度低,即分子大而荷电小,以减少电流的产生。
  5)只要条件允许,尽可能采用酸性缓冲液。在低pH值下,吸附和电渗流都很小,毛细管涂层的寿命较长。
  6)与毛细管种类匹配,涂层毛细管只能在一定pH范围内使用。
  (2)缓冲液pH值的选择:
  1)缓冲液pH值的选择与样品性质有关。
  ①通常酸性组分选择在碱性条件下分离。
  ②通常碱性组分选择在酸性条件下分离。
  ③蛋白质、多肽和氨基酸等两性物质可选酸性(pH = 2)或碱性(pH>9)分离介质。
  ④糖类样品通常在pH = 9~11能获得最优分离。
  ⑤羧酸或其它样品多在pH = 5~9选择分离条件。
  2)缓冲液pH值的选择和毛细管种类有关。
  很多涂层毛细管只能在一定pH范围内使用,如聚丙烯酰胺涂层毛细管只能在pH = 4~9使用,否则涂层易水解失效。
  3)在相同pH下,不同缓冲液的分离效果可能相差很大。
  一般来说,能与样品发生相互作用的试剂可能是最好的。如分离糖类和DNA等分子时应优先使用硼酸盐缓冲液,因为硼酸根能与糖羟基形成配位键,增加糖的负电荷和分离度。硼酸盐缓冲液也适用于分离其它含邻羟基和多羟基的化合物。
  4)为了选择合适的pH值,需要用pH调节剂调整介质的酸碱性。
  由于多数缓冲试剂是酸性物质如磷酸,所以pH调节剂主要是碱类。常用pH调节剂有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有机碱如乙醇胺和乙二胺。如果缓冲试剂为碱类,可用酸作为调节剂,尽量使用弱酸如H3PO4。
  缓冲试剂和调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附和控制焦耳热等都有影响。一般缓冲试剂的浓度在10~200mmol/L,有时为了抑制蛋白质等的吸附作用,浓度可高达500mmol/L(此时应减少分离电压)。电导率大的缓冲试剂如磷酸盐和硼酸盐等的浓度一般在20mmol/L,电导率小的缓冲试剂如硼酸的浓度可在100mmol/L以上。
  2、添加剂:
  如果缓冲液经各种参数优化后仍无法给出良好的分离结果,可加入添加剂以改善分离。常用添加剂有:
  (1)无机电解质:NaCl和KCl等。
  (2)有机溶剂:甲醇和乙腈等。
  (3)非电解质高分子:纤维素、多糖、聚乙烯醇和Triton X-100等。
  (4)功能性添加剂:手性冠醚和环糊精等。
  3、分离电压:
  分离电压是控制柱效、分离度和迁移时间的重要因素。分离电压与毛细管内径和长度及缓冲溶液浓度(离子强度)有关,电压的极值范围因系统和组成而异。
  当柱长一定时,在一定电压范围内,电压与粒子的迁移速度成线性关系。
  当电压过高时,线性关系偏移,主要是由高电压引起的焦耳热造成的。电压升高,产生的焦耳热增多,在不能有效驱散所产生焦耳热的情况下,柱温会显着升高,工作电流增大,柱效和分离度降低。除了采取有效的散热措施外,选择合适的条件,使在此条件下允许使用较高电压,而不致产生过大的电流和过多的焦耳热,是非常重要的。一般通过作I-V曲线来选择体系的最优分离电压。
  4、分离温度:
  毛细管的温度不仅影响分离的重视性,而且影响分离效率。温度选择应考虑热效应、分析重现性、分离效率和分离介质对温度的限制等因素。
  温度应通过实验确定。多数情况下,在20~30℃进行电泳能获得良好的分离效果。一些糖类样品需要高于室温的分离条件,一些样品如蛋白质等可能需要低于室温的分离条件。
  五、应用:
  CZE是CE最基本、应用最广的分离模式。
  可分离蛋白质、多肽和带电荷的大小分子。

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